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GenSight y su terapia optogenética avanzan hacia un ensayo clínico en humanos

05 de diciembre 2013 - GenSight , una compañía de desarrollo de la terapia génica recién formada en Francia, está haciendo un progreso significativo en el avance del tratamiento por optogenética para restaurar la visión en las personas que han perdido la totalidad de sus fotorreceptores por enfermedades de la retina tales como retinitis pigmentosa ( RP).

El objetivo de la empresa es poner en marcha un ensayo clínico en 2015.

"Cuando formamos la empresa, pensamos en los mejores enfoques para revertir la ceguera, especialmente afecciones huérfanas", dice Bernard Gilly , Ph.D., co-fundador y presidente ejecutivo de GenSight. "Y era importante para nosotros ayudar a los pacientes que podrían sufrir de ceguera durante 20 años o más."

El proyecto se basa en la promoción de una terapia similar en el desarrollo en el Instituto de la Visión - un esfuerzo encabezado por José-Alain Sahel , MD, en París, y financiado a través de la Fundación por el Programa de Aceleración de Investigación Traslacional (TRAP). Establecida en 2008, la meta de TRAP es acelerar el avance de los tratamientos prometedores de enfermedades de la retina en los estudios en humanos. Veinte millones de dólares se dirigen anualmente a proyectos financiados por TRAP.

Optogenética es un enfoque terapéutico emergente que implica la entrega de genes a las células de la retina, el cerebro u otro tejido neural para que sean sensibles a la luz. Además de ser desarrollado para enfermedades de la retina, la optogenética muestra potencial para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, trastornos del sueño, la depresión y otros trastornos neurológicos. Al hacer que las células nerviosas sensibles a la luz, pueden ser controlados para minimizar o revertir los síntomas.

El tratamiento optogenético de GenSight utiliza un virus adeno-asociado (AAV) para la entrega de un gen que expresa halorhodopsina , una proteína sensible a la luz similar a la rodopsina , que se produce de forma natural en los fotorreceptores para hacer posible la visión. El tratamiento se administra a cualquiera de los fotorreceptores no funcionales o, en los casos en que los fotorreceptores han sido completamente perdidos, a las células de la retina interna, tales como las células bipolares , que a menudo sobreviven en las enfermedades avanzadas.

Dr. Gilly dice que una interfaz visual - un par de gafas de alta tecnología con una cámara - también está siendo desarrollada por GenSight para mejorar las experiencias visuales de los pacientes que recibieron la terapia génica optogenética. En términos sencillos, la interfaz proporciona algunas de las funciones de procesamiento visual que los fotorreceptores normalmente proporcionarían, y también entrega la luz a las células bipolares en una longitud de onda que activa la halorhodopsina.

Hasta el momento los investigadores han demostrado que el tratamiento provoca el comportamiento visual en un modelo de ratón de la degeneración retiniana avanzada, así como sensibilidad a la luz en un cultivo de células de la retina humana. "Creemos que esto es una gran prueba de concepto", dice el Dr. Gilly.

En preparación para un ensayo clínico, se llevarán a cabo estudios de toxicología. GenSight producirá también el tratamiento mediante buenas prácticas de fabricación para asegurarse de que cumple con los estándares de calidad y seguridad para su uso en seres humanos.

Mientras que la terapia inicialmente se estudiará en los seres humanos con enfermedades hereditarias de la retina, el Dr. Gilly dice que la compañía también le gustaría tener con el tiempo a disposición de las personas con degeneración macular relacionada con la edad.

 

Fuente: FFB

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QLT se prepara para un tratamiento potencial de la amaurosis congénita de Leber y RP

QLT Inc. anunció que pronto finalizará el protocolo de su ensayo clínico de QLT091001 para el tratamiento de enfermedades de la retina heredados como Amaurosis Congénita de Leber y retinitis pigmentosa, según un comunicado de prensa de la compañía.

La compañía dijo en el comunicado que también ha comenzado a reclutar a pacientes para un ensayo de prueba de concepto de fase 2a de este agente en los adultos con problemas de adaptación a la oscuridad.

Además,  QLT ha puesto en marcha un programa de uso compasivo de QLT091001 en  Amaurosis congénita y RP.

"Estamos muy contentos con el progreso que QLT ha hecho con el programa de este año pasado y miramos hacia adelante a los próximos meses que serán muy productivos, mientras nos preparamos esta importante terapia para un ensayo fundamental," dijo el Presidente de la Junta QLT Jason M. Aryeh en el comunicado.

 

Fuente: Healio.com

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La próxima Terapia genética: Un desafío contra las enfermedades autosómicas dominantes

22 de noviembre 2013 - En la reunión de la Fundación para el Programa de Aceleración de Investigación Traslacional (TRAP) investigadores reunidos en Las Vegas a principios de esta semana, Al Lewin , Ph.D., de la Universidad de Florida, habló sobre los avances en la lucha contra el problema de desarrollar terapias de gen para enfermedades autosómicas dominantes de la retina - específicamente retinosis pigmentaria (RP) causada por mutaciones en el gen de la rodopsina (RHO).

El proyecto de su equipo es uno de los 20 financiados a través de TRAP, que actualmente se dirige a $ 20 millones anuales para el avance de la investigación prometedores en estudios con humanos.

Las terapias de reemplazo de genes actualmente en estudios en humanos se dirigen a varias condiciones de la retina de tipo autosómicos recesivos y no son en absoluto triviales empresas. El uso de los virus humanos de ingeniería para entregar el ADN sano para reemplazar el ADN defectuoso, causante de la enfermedad en las células de la retina es una técnica de última generación que aún está en una fase inicial de desarrollo clínico. Sin embargo, las terapias genéticas recesivas implican un enfoque de un paso relativamente sencillo: reemplazar el gen defectuoso, que no está funcionando.

El tratamiento de enfermedades de la retina autosómica dominante es un desafío más complejo, ya que los investigadores tienen que hacer frente a una copia del gen que expresa una proteína tóxica y otro que está funcionando normalmente.

"Para la enfermedad dominante, es posible que debamos silenciar la expresión del gen mutado, además de la entrega de una copia normal. Es posible que tengamos un proceso de dos pasos ", dice el Dr. Lewin. "Es complicado, ya que hay que suprimir el gen mutado, en nuestro caso RHO, sin tener un efecto secundario de otros genes con el agente de silenciamiento."

RHO es una importante diana terapéutica porque las mutaciones en que causan alrededor del 25 por ciento de la RP autosómica dominante.

Dr. Lewin está investigando dos enfoques de silenciación de genes. Uno utiliza una ribozima , una enzima que puede ser diseñado para actuar como lo que él llama unas "tijeras moleculares". Es dar tijeretazos del ARN, los mensajes procedentes del gen mutado. La otra técnica emplea ARN de interferencia corta, colocando una máquina de silenciación de genes que ya en la célula provoca la degradación del ARN mutante.

Si bien la estrategia de silenciar y reemplazar es un logro para su equipo, el Dr. Lewin dice que un enfoque de un solo paso podría seguir siendo viable en algunos casos. Descubrió que acaba anulando el gen mutante con un gen sano y que a veces puede hacer el truco.

"Hemos encontrado, en el curso de nuestros estudios, que dos pasos pueden no ser necesarios para algunas mutaciones RHO. Sólo puede ser que necesite para entregar una copia normal del RHO para suprimir el efecto del mutante ", dice. "Es probablemente una cuestión de cambiar el equilibrio para tener RHO más normal para preservar los fotorreceptores, ralentizar la degeneración significativa y conservar la vista."

"Se puede pensar en las dos copias del gen como si fueran dos emisoras de radio. En una suenan The Beatles y enla otra se oye estática ", explica Stephen Rose, Ph.D., director de investigación de la Fundación."Si se puede poner a The Beatles en voz alta lo suficiente, usted podría ser capaz de anular la estática porque no es perceptible. Sin embargo, no se puede poner a The Beatles demasiado fuerte o dañara sus oídos. "

En 2011, el Dr. Lewin, junto con Marina Gorbatyuk, Ph.D., y William Hauswirth, Ph.D., sus colaboradores en la Universidad de Florida, fueron honrados con la Fundación con el Premio del Consejo Director para el descubrimiento de la técnica de anulación.

Genable , una empresa de desarrollo de genes en Irlanda, también está asumiendo el reto de desarrollar terapias génicas para enfermedades de la retina autosómicas dominantes. Ellos se dirigen a mutaciones RHO con una terapia de dos pasos.

"Nosotros y Genable somos competidores amistosos", dice el Dr. Lewin. "Hemos leído los documentos de investigación de ellos. Y sé que van a hacer un buen trabajo observando nuestras comunicaciones, porque realmente quieren saber lo que estamos haciendo ".

Su equipo ha demostrado hasta el momento la seguridad y la eficacia de sus enfoques en un modelo de ratón y se mueve a los estudios con animales más grandes, incluidos los caninos.

"Estamos enfocados en mover las formas más prometedoras de tratamiento en ensayos clínicos tan pronto como nos sea posible", dice el Dr. Lewin. "Agradecemos el generoso apoyo de la Fundación para este importante trabajo de traducción, y entendemos la urgencia de sacarlo a los pacientes."

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Revisión de la Terapia Genética por Jean Bennett.

Keirnan Willett 1 y Jean Bennett 1

Abstracto

El ojo ha estado a la vanguardia de la terapia génica traslacional en gran parte debido a los objetivos adecuados de enfermedades, la accesibilidad anatómica y privilegios inmunológicos bien estudiados. Estas ventajas han impulsado la investigación que culminó en varios ensayos clínicos y el virus adeno-asociado (AAV) se ha convertido en el vector de elección para muchas terapias oculares. Investigaciones pre-clínicas y clínicas han evaluado las respuestas inmunes humorales y celulares a una variedad de origen natural y desarrollado serotipos de AAV, así como sus transgenes entregados y estos datos se han correlacionado con potencial de secuelas clínicas. Resulta alentador que AAV parece ser seguro y eficaz con un seguimiento clínico superando 5  años en algunos estudios. Como objetivos de enfermedades continúan expandiéndose por AAV en el ojo, la evaluación completa y deliberada de la seguridad inmunológica es fundamental. Con un cuidadoso estudio, el desarrollo de estas tecnologías debe informar al mismo tiempo la biología de la respuesta inmune ocular.

 

Introducción

La deficiencia visual es una carga considerable para la sociedad. Por las estimaciones de los años de vida ajustados por discapacidad, trastornos visuales y enfermedades relacionadas son comparables a las enfermedades diarreicas y el VIH / SIDA, cuando se mide a nivel mundial ( 1 ). Mientras que la mayoría de la ceguera en el mundo es evitable para la prevención o el tratamiento, se ha avanzado poco en las causas pendientes, muchos de los cuales provienen de lesiones genéticas bien descritos. La terapia de transferencia génica se ha avanzado enormemente en las últimas décadas, y ha logrado un éxito con la eficacia clínica de virus adeno-asociado (AAV) aumento génico mediado en el ojo para Amauro sis congénita de Leber  tipo 2 ( 2- 4 ).

Otros virus como el adenovirus y lentivirus han sido o están siendo investigados por la entrega de genes. En comparación con estos modos no virales y virales también de la transferencia de genes, AAV recombinante sigue siendo un vector popular que se usa en el ojo tanto en la ciencia básica y estudios de traducción (Figura (Figura 1). 1 ). En la actualidad, los ensayos clínicos con la administración ocular de AAV están llevando a cabo en cuatro continentes, con una matrícula total de más de 200 participantes (Figura (Figura 2). 2 ). AAV, un parvovirus ADN de hebra sencilla ayudante-dependiente,  nunca se ha demostrado que causa la enfer

medad en humanos o animales. Es atractivo como un vector, ya que de forma estable y eficiente puede inducir la expresión de genes o en la división de las células diferenciadas terminalmente, tiene un perfil de toxicidad favorable y respuesta inmune benigna. Además, la manipulación de la cápside de AAV, así como promotores en el transgén de ADNc modulan efectivamente el tropismo celular que es crítico para la fisiopatología específica de células de muchas enfermedades de los ojos ( 5 ).

 

Figura 1

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Tendencias en vectores estudiados para la terapia génica en el ojo . (A) Número de resultados devuelto cuando se cuestionó la base de datos MEDLINE a través de PubMed para "aav ojos 2001", etc (B) registrados recientemente ensayos clínicos por año a partir de la terapia génica de base de datos .. .

 

Figura 2


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Los ensayos clínicos de AAV ocular registrados en www.clinicaltrials.gov . Buscado como término de búsqueda  =  ojo y las intervenciones  =  virus adeno-asociado o VAA O rAAV. Número de pacientes reportados como números reales o previstos para la inscripción. ...

Anatómicamente, el ojo es muy compartimentado y muchas vías de administración de AAV se han estudiado a los tejidos objetivo, ya sea anterior o posterior (Figura (Figura 3). 3 ). Por ejemplo, la inyección de la glándula lagrimal ( 6 ), gotas tópicas oculares ( 7 , 8 ), la inyección corneal intraestromal ( 9 ), y intra-cameral de inyección ( 10 ) proporciona acceso a la superficie ocular, córnea, cámara anterior y que son implicado en la enfermedad del ojo seco, distrofias corneales, y el glaucoma. Inyecciones intravítreas y sub-retiniano acceder a la retina neurosensorial y el epitelio pigmentario de la retina subyacente (RPE). La administración sistémica de los reactivos de terapia génica es una alternativa teórica para la cirugía intraocular que evita las complicaciones potenciales de la inyección sub-retiniano. La administración intravenosa o intramuscular durante el período neonatal en animales se ha demostrado para transducir difusamente la retina ( 11 ). Una limitación importante de este enfoque, sin embargo, es el aumento muy grande en la dosis de vector en comparación con la entrega intraocular, aunque ciertas mejoras técnicas podrían ser investigadas - por ejemplo, la adaptación de los métodos de entrega de quimioterapia a través de la canulación súper selectiva de la arteria oftálmica ( 12 ). La estrategia sistémica se limita aún más por la barrera de sangre del cerebro maduro, las muchas regiones avasculares del ojo, y el potencial para una inflamación perjudicial en el contexto de una gran carga necesariamente antígena. Por el contrario, cada uno de los compartimentos intraoculares requiere un volumen relativamente pequeño de la inyección y por lo tanto vector altamente purificado es eficaz en pequeñas dosis ( 13 ). La transparencia del ojo también es ventajoso en que proporciona una visualización directa no invasiva de tejido neural y vascular, así como otras estructuras críticas del ojo - facilitar la investigación en modelos animales y cerca de seguimiento en la clínica. Además, la simetría de la progresión de la enfermedad en la mayoría de enfermedades de la retina hereditarias permite que un ojo se utiliza como el objetivo experimental y el otro como control en los estudios de investigación.

 

Figura 3

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Esquema de enfoque anatómico para la administración de vectores de terapia génica en el ojo . Hacia la izquierda de la parte superior izquierda - LG, la glándula lagrimal, T, gota ocular tópica, IS, intra-estromal de la córnea; IC, ​​intra-cameral, es decir, la cámara anterior; IVI, intravítrea; ...

Hasta el momento, las enfermedades de la retina han ganado el mayor interés entre los objetivos oculares para la terapia génica y serán el foco de esta revisión.

 

Inmunidad en el ojo

Para mantener las estructuras transparentes requeridas para la visión, el ojo ha conservado un número de adaptaciones que disminuyen selectivamente una respuesta inmune máxima. Por ejemplo, los anticuerpos que fijan el complemento, neutrófilos, y macrófagos se excluyen generalmente de la vista como potencial daño colateral podría dar lugar a lesiones y opacidades. Anatómicamente, la retina es una extensión del sistema nervioso central y está protegido por una barrera de sangre-retina selectiva (BRB) establecido por los capilares no fenestrado en la vasculatura de la retina y uniones estrechas en el EPR. Además, la naturaleza avascular de la mayor parte de los ojos y la falta de vasos linfáticos que drenan la cámara anterior, la cavidad vítrea, o el espacio subretiniano limitan aún más la presentación de antígenos clásica y la respuesta inmune ( 14 ). Si las moléculas solubles o asociada a las células pasan por alto estos obstáculos, los antígenos están sujetos a una llamada respuesta "desviada" inmune en el ojo. La cámara anterior es el punto de entrada más estudiado de estas respuestas, y fue descrito originalmente por el premio Nobel Peter Medawar en su estudio de los trasplantes de córnea y su supervivencia sin inmunosupresión ( 15 ). Denominado antero-cámara de desviación inmune asociada (DIACA), este fenómeno se caracteriza clásicamente por la eliminación de la respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) contra el antígeno presentado. Esta respuesta está mediada por una población de células T reguladoras específicas de antígeno (Treg) que se elaboran en un proceso de múltiples etapas que implica el ojo, así como del bazo, y estos mecanismos son revisados ​​a fondo por Streilein ( 14 ). Esta población de células Treg puede ser transferido a los animales no tratados previamente que adoptan la supresión de la DTH. No es sorprendente, este mecanismo de inmunosupresión es de considerable interés para el tratamiento de enfermedades autoinmunes y reproducir el entorno de citoquinas necesario in vivo o in vitro se ha demostrado que cultivar eficazmente las poblaciones de Treg similares que mitiguen la encefalomielitis autoinmune en modelos animales ( 16 ). Similar a la cámara anterior, antígenos introducidos en el espacio vítreo y sub-retiniano pueden exhibir una respuesta inmune desviada análoga ( 14 , 17 ).

El medio ambiente de citoquinas en cada uno de estos compartimentos oculares se piensa que es crítico para una respuesta desviada. Por ejemplo, factor de crecimiento transformante β 2 (TGFß2) fue la primera de dichas citocinas que se describe y está presente en el vítreo, la retina, y el humor acuoso. La retina contiene, además, péptido intestinal vasoactivo (VIP) y la somatostatina (SOM), mientras que el humor acuoso contiene estos, así como α-hormona estimulante de los melanocitos (α-MSH) y el péptido relacionado con el gen calcitonina (CGRP). Mientras que todas estas moléculas se cree que contribuyen a la inmunosupresión, sus diversas combinaciones en compartimentos separados oculares pueden ser la base de las diferencias sutiles en la desviación inmune entre ellos ( 18 ).

Después de la exposición del antígeno, la respuesta inmune celular en el ojo es similar modulada por citocinas. La células T auxiliares de tipo 1 (Th1) de respuesta, por ejemplo, es en general perjudicial para los tejidos oculares. Las células Th1 secretan interferón γ (IFN-γ), que a su vez activa los fagocitos y estimula la producción de IgG2a - una clase de fijación del complemento de anticuerpos que incurren en daños colaterales. Por el contrario, se cree que las respuestas Th2 a ser mejor tolerada en el ojo y pueden suprimir la activación de los macrófagos. Ellos se caracterizan por las citoquinas antiinflamatorias IL-4, IL-10, IL-13 y - un medio que favorece la IgG1, IgG3, e IgG2b que no fijar proteínas del complemento. No está claro en la literatura si esta población a veces llamado "cross normativo" de las células Th2 en realidad se superpone con la población Treg. Ambos se cree que se elaborará en el entorno de TGF y la IL-10 y ambos son conocidos por suprimir la activación de los fagocitos. Células Treg son CD25 + y FoxP3 + y contienen sub-poblaciones de CD4 + células "aferentes" que suprimen la iniciación de las células Th1 y CD8 + células "eferentes" que suprimen la acción de Th1 ( 18 ).

La regulación de estas respuestas inmunes es crítica para la seguridad de la transferencia de genes en el ojo. Una respuesta inflamatoria no se controla podría dañar el tejido neural, tales como los fotorreceptores, que son post-mitótico en el nacimiento y no se regeneran durante toda la vida. La eficacia de la transferencia de genes depende de manera similar en la tolerancia inmune a un vector viral, así como los productos de un transgén que puede ser novedoso para el organismo huésped. La investigación en terapias de transferencia de genes, por lo tanto, se ha intentado describir tanto las respuestas inmunes celulares y humorales para el aumento del gen en el ojo en modelos animales y ensayos clínicos humanos en curso.

 

Los ensayos para la medición de la respuesta inmune a AAV

Varias técnicas se han adoptado comúnmente para caracterizar la respuesta inmune ocular a las tecnologías de AAV. Las respuestas humorales se ensayaron típicamente por ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), que proporciona la cuantificación de la producción de anticuerpos específicos y también pueden ser refinados a las clases de sub-tipo de anticuerpos característicos de ciertas vías inmunes ( 19 ). Estos anticuerpos se pueden medir en el suero así como el humor vítreo y acuoso, y una comparación conocido como el coeficiente de Goldmann-Witmer (GW) históricamente ha sido utilizado para localizar la producción de anticuerpos, ya sea dentro o fuera del ojo ( 19 , 20 ). Además, una prueba funcional in vitro de la transducción de AAV puede llevarse a cabo en presencia de los sueros de ensayo, comúnmente llamado un ensayo de anticuerpos neutralizantes (NAB). En este experimento, las diluciones de suero que inhiben la transducción se pueden comparar, y reflejan la presencia de factores neutralizantes - presumiblemente anticuerpos - que inhiben la transducción de AAV.

Las respuestas inmunes celulares también pueden ser precipitados por AAV o productos transgén. Un punto de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISPOT) se utiliza a menudo para cuantificar las poblaciones de leucocitos que se activan en respuesta a los epítopos de interés. Comúnmente, IFN-γ producción se utiliza para definir la activación y, en general refleja una respuesta de tipo Th1, aunque otros marcadores pueden ser utilizados ( 21 ). Estudios recientes también han seguido de cerca la respuesta inmune celular mediante citometría de flujo de detección de marcadores de activación en las células CD4 + y CD8 + compartimentos, como Ki67, HLA-DR y Bcl-2 ( 22 , 23 ), sin embargo este método no permite la caracterización epítopo utilizando péptido específicos.

Por último, en estudios con animales, los cambios histológicos también reflejan la respuesta inmune local en los tejidos de interés. La proliferación de células gliales es una reacción a los sistemas CNS y puede ser visualizado por las sondas de detección inmunohistoquímicas de proteína glial fibrilar ácida (GFAP) ( 24 , 25 ). También, leucocitos infiltrantes, incluyendo macrófagos activados puede ser visualizado con anticuerpos contra CD45, CD68, Iba1, y otros ( 19 , 24 ).

 

Ensayos clínicos para la degeneración retiniana

Cuatro grupos independientes han publicado los resultados de seguridad y eficacia en los ensayos clínicos de aumento génico con AAV2 para los pacientes deficientes en el 65 RPE-isomerasa específica  kDa proteína (RPE65) ( 2- 4 , 26 ). El gen que codifica RPE65 es uno de al menos 18 genes que, cuando mutan, se sabe que causa la degeneración de la retina rápida conocida como amaurosis congénita de Leber 1 . Algunos de los primeros ensayos excluyeron pacientes con mutaciones nulas para eliminar la posibilidad de que la proteína introducida RPE65 no pudieran ser reconocidas ( 4 ), sin embargo algunos no hacen esta exclusión ( 2 ). La seguridad desde una perspectiva inmunológica se evaluó clínicamente y mediante la evaluación de laboratorio.

El seguimiento ha superado 5  años en los tres primeros grupos y hasta la fecha no hay eventos adversos que se han reportado ( 27- 29 ). Por examen clínico, no hay respuesta inflamatoria significativa que se haya atribuido a la AAV o producto transgén. Los estudios de biodistribución han sido parte de cada uno de los tres ensayos iniciales y utilizado reacción en cadena de polimerasa de secuencias de AAV en diversos compartimentos, incluyendo las lágrimas, suero, saliva, y semen. Los resultados han sido generalmente negativos con la excepción de positividad transitoria en el suero y las lágrimas que se resolvió a los pocos días después de la operación.

Para evaluar la respuesta humoral adaptativa a la cápside AAV2, se realizaron ensayos funcionales de NAb. En general, los ensayos de NAb fueron negativos con la excepción de un paciente en el estudio de Maguire et al. ( 2 ) que experimentó un aumento en NAb que luego se redujo a un nivel ligeramente superior al valor inicial. En el estudio Hauswirth et al. ( 3 ), los títulos de NAb no se midieron funcionalmente, pero los anticuerpos según la evaluación por ELISA fueron positivos en un sujeto transitorio. En el ojo estas respuestas han sido mucho menos que los inducidos por AAV sistémicamente inyectado por varias unidades de registro ( 30 ). Respuestas humorales de adaptación para el transgén se evaluaron por ELISA en el suero de los estudios Bainbridge y Maguire y los resultados fueron negativos ( 2 , 4 , 31 ).

La inmunidad adaptativa celular a la cápside AAV2 que se mide a través de ELISPOT fue negativa en cada uno de los tres estudios seminales ( 2- 4 ). Además, Hauswirth et al. se ensayó la respuesta antígeno-específica en la proliferación de linfocitos (ASR) por la captación de timidina tras la exposición a antígeno de AAV2, que fue negativa inicialmente y a 1 año después del seguimiento ( 3 , 32 ). Por último, la inmunidad celular adaptativa contra el producto del gen RPE65 entregado fue ensayada por Bennett et al. mediante ELISPOT y eran generalmente negativas con dos excepciones que se supone son artefacto ( 2 , 31 ).

Los resultados inmunológicos benignos de la re-administración sub-retinal de AAV2.hRPE65 se discuten más adelante en este informe ( 19 ).

 

Ampliar Objetivos en la degeneración de la retina

Muchas degeneraciones hereditarias de retina (DR) que se caracterizan clínicamente por primera vez ahora tienen una etiología genética descrita y las pruebas pertinentes se está convirtiendo en más barato y más disponible para los médicos. El Instituto Nacional del Ojo (NEI), ahora ofrece un programa llamado eyeGENE que las pruebas de enfermedades oculares hereditarias conocidas y compila los resultados en una base de datos que está a disposición de los investigadores y los clínicos ( 33 ). Tal vez el más susceptible de estas dianas genéticas son enfermedades autosómicas recesivas (AR) que confieren una mutación de pérdida de función que puede ser potencialmente compensado por el aumento de gen. Como se discutió anteriormente, la primera de estas mutaciones específicas a las que va dirigido para la terapia génica en los seres humanos era la AR LCA2. Este era un objetivo inicial atractivo debido a que (1) el 1,6  kB transgén es lo suficientemente pequeño como para caber en la cápside de AAV2 (<4,7  kB), (2) de ratón y canino modelos de la enfermedad están disponibles, (3) el componente degenerativo en este enfermedad en particular es lenta, proporcionando de este modo una amplia ventana terapéutica, y (4) las células primarias son efectuadas EPR que son transducidas eficientemente por inyección subretiniana de AAV2. LCA2 es una enfermedad poco frecuente, sin embargo, con una incidencia de ~ 1:200.000, que asciende a un estimado de 500 casos en los Estados Unidos.

La prueba de concepto de la terapia de reemplazo de genes se ha demostrado en animales sin respuesta inflamatoria significativa en somática recesiva y RD ligada al cromosoma X se dirige el uso de virus recombinantes incluyendo albinismo oculocutáneo ( 34 ), retinosquisis juvenil ligada al cromosoma x (XLRS) ( 35 , 36 ), y acromatopsia ( 37 , 38 ). El fenotipo de la retinitis pigmentosa (RP) abarca> 100 mutaciones, algunas de las cuales incluyen el fenotipo LCA por ciertas nomenclaturas. En esta categoría, varios objetivos de genes AR se han validado de manera similar en modelos animales para el posible aumento de gen: RPGR ( 39 ), GC1 ( 40 ), RPGRIP1 ( 41 ), MERTK ( 42 ), y AIPL1 ( 43 ). Además, los estudios análogos se han hecho para la enfermedad de Stargardt con mutaciones en ABCA4 utilizando lentivirus ( 44 ), así como el síndrome de Usher Ib causadas por mutaciones en MYO7A utilizando AAV ( 45 ).

Además, las mutaciones con ganancia de función tóxicos característicos de la enfermedad autosómica dominante pueden ser objeto de un enfoque de dos pasos - primero por derribar el gen defectuoso por la interferencia de ARN (RNAi), entonces el suministro de una molécula de reemplazo resistentes a la RNAi introducido. Este enfoque está siendo estudiado en las mutaciones de la rodopsina ( 46 , 47 ) y RDS / periferina ( 48 ). Alternativamente, la administración de una molécula de tipo salvaje puede ser suficiente en algunos casos ( 49 ). Hasta ahora no ha habido ningún efecto tóxico claro de la entrega de la rodopsina o RDS / periferina en los animales deficientes en estas proteínas.

Entrega de factores pro-supervivencia y anti-apoptótica genéricos ha sido investigado como un tratamiento generalizado para un conjunto diverso de enfermedades de la retina, que van desde la RP a acromatopsia, a la degeneración macular 2 . Entrega mediada por AAV de uno de estos factores, el factor neurotrófico ciliar-derivado (CNTF) se ha llevado a cabo en modelos animales con excelente éxito ( 50 ). En ciertas circunstancias, sin embargo, parece que el efecto protector anatómico de CNTF puede disminuir al mismo tiempo función de la retina medida por electrofisiología. Células factor neurotrófico derivado de la línea glial (GDNF) es una alternativa potencial que proporciona neuroprotección estructural sin efectos electrofisiológicos adversos a la misma dosis ( 51 ). Estudios adicionales en modelos celulares y animales han identificado agentes neuroprotectores alternativos, tales como la eritropoyetina (EPO) ( 52 ), varilla derivados de factor neurotrófico ciliar (RdCVF) ( 53 ), y el inhibidor ligada a X de apoptosis (XIAP) ( 54 ). Hasta ahora, no ha habido respuestas significativas relacionadas con la inmunidad tóxicos en modelos animales para estas proteínas nativas.

Retinoblastoma y otras neoplasias oculares también son objetivos potenciales para la terapia génica que utilizan AAV para suministrar terapias que no son bien tolerados sistémica, tales como la lucha contra el cáncer de la señalización de la proteína interferón beta (IFN-β) ( 55 ) o compuestos citotóxicos ( 56 ). En modelos de ratón, la inyección intravítrea de AAV2.Ifn-β mostró efectos anti-tumorales y la expresión del transgen se limitan a los ojos. No se informó de la respuesta inmune abierta, y en estas situaciones, un cierto grado de activación inmune podría mejorar la regresión del tumor.

 

Anti-angiogénesis

Retinopatía que implica la vasculatura son la principal causa de ceguera en edad de trabajar y los adultos mayores en los países desarrollados, que comprenden la retinopatía diabética ( 57 ) y la forma neovascular de la degeneración macular relacionada con la edad ( 58 ), respectivamente. Tratamiento eficaz está ahora disponible en la forma de moléculas que inhiben el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), pero sus efectos son temporales y requieren inyecciones intravítreas repetidas que pueden ser un inconveniente para los pacientes y proveedores. El uso de la terapia génica para inducir la producción de moléculas anti-angiogénicos por las células endógenas podría representar una solución duradera para estas condiciones comunes.

Factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) es una diana anti-angiogénico atractiva, ya que se opone a la acción de VEGF y es también un factor pro-supervivencia de neuronas de la retina. Extensos estudios en animales condujeron a un ensayo clínico de adenovirus para entregar PEDF ( 59 ), y un poco de inflamación leve a moderada se detectó en el 25% de los pacientes, pero por lo demás no se observaron efectos adversos. Mientras adenovirus parece tener un perfil de seguridad aceptable en este estudio, la duración limitada de la respuesta favorece AAV para estudios futuros. Dos ensayos adicionales en curso emplean AAV2 para entregar el receptor de VEGF soluble sFlt intravítrea (en un estudio) y sub-retinalmente (en el otro). Datos de primates que apoyan el juicio AAV2.sFlt intravítrea ( 60 ) evaluaron las respuestas inmunológicas y encontraron leves a moderados efectos evidentes en el examen clínico, así como las pruebas de laboratorio incluyendo anticuerpos inducidos a AAV2 en todos los animales. El tiempo dirá si estos efectos son identificados en los seres humanos.

 

Métodos para mejorar la eficiencia

Varios métodos técnicos de la mejora de la eficiencia y la especificidad de la transducción de AAV en el ojo han sido investigados, tales como el uso de promotores de transgenes específicos de las células ( 61 ), los serotipos de AAV de ingeniería ( 24 , 25 ), ultrasonido micro burbujas ( 62 ), y la co-administración de cualquiera de los fármacos quimioterapéuticos ( 63 ) o de adenovirus ( 64 ). No se sabe cómo estas técnicas adyuvantes podrían afectar la respuesta inmune en los seres humanos, pero se podría especular que los antígenos y la interrupción de las barreras celulares adicionales podrían influir en la presentación de antígenos y la infiltración inmune. En la actualidad, la terapia de la transferencia de genes en el ojo humano para LCA2 no está claramente limitada por la eficacia de transducción, pero como se desarrollan más indicaciones, la necesidad de un adyuvante puede llegar a ser relevante. En situaciones en las que la dosis de transgén es limitada, podría ser preferible para aumentar la eficiencia de la transducción viral o modular promotores para aumentar la expresión de la proteína transgénica, en lugar de aumentar la dosis de vectores virales potencialmente inmunogénicos. Del mismo modo, podría ser ventajoso utilizar construcciones transgénicas que son farmacológicamente inducible, de modo que las respuestas inmunes iniciales a la lesión quirúrgica y cápsides virales no conducen a la inmunidad inducida por espectador contra los productos transgén terapéutico ( 65 ).

 

Repita Administración de AAV

Una consideración práctica y ética de los ensayos clínicos de AAV en el ojo es el tiempo de tratamiento del ojo contralateral. Hay una preocupación teórica de que después de la exposición a la cápside de VAA o transgén durante el tratamiento inicial, el sistema inmune podría adoptar la memoria. Por lo tanto, una inyección posterior en el ojo contralateral podría resultar en una respuesta del sistema inmune imprimada que disminuye la eficacia de la terapia, o peor, provoca la inflamación destructiva. Una teoría alternativa apoyada por los datos actuales es que la terapia génica ocular induce una respuesta inmune desviada DIACA análoga a como se discutió anteriormente. En este modelo, el entorno de citoquinas de la presentación del antígeno induce una población sistémica de Treg que inhiben la respuesta inmune celular a una segunda presentación de AAV o transgén. Esta respuesta DIACA-como, sin embargo, varía con el compartimiento ocular inyecta. Mientras que la inyección subretiniana parece reflejar la cámara anterior con respecto a una respuesta desviada inmunosupresor ( 17 , 66 ), se ha demostrado que la inyección intravítrea de un ojo puede estimular NAb que disminuyen eventos de transducción en el ojo contralateral en modelos animales ( 67 ) - incluyendo nuevos serotipos de AAV por ingeniería genética para transducir la retina externa a través de una inyección intravítrea ( 24 ).

Del mismo modo, la re-administración sistémica de vectores de terapia génica para otros objetivos de enfermedades han demostrado la neutralización de eventos de transducción debido a anticuerpos preformados en varios modelos animales, incluyendo la fibrosis quística ( 68 ) y la hemofilia B ( 69 ). En los ensayos clínicos iniciales de los pacientes con hemofilia B, se lograron niveles terapéuticos de la coagulación deficiente en factor IX, pero sólo persistieron ~ 8  semanas ( 21 ). En este caso, parece que aunque los pacientes con anticuerpos neutralizantes preexistentes fueron excluidos, una respuesta celular a la cápside de VAA incurrió en la eliminación selectiva de las células transducidas, y estudios recientes sugieren que esta limitación puede evitarse con ciertos regímenes inmunosupresores ( 70 ). Estas respuestas inmunes a la administración sistémica en presencia de NAb parecen diferir de sub-retiniano administración repetida posiblemente debido al espacio inmune-privilegiada y cerrada de la sub-compartimento retina. Sin embargo, otros estudios en los tejidos no oculares han demostrado que a pesar de la presencia de NAb, todavía pueden ocurrir eventos de transducción en los sitios sistémicos ( 71 ), lo que subraya la variabilidad de la respuesta en diferentes tejidos y estados de enfermedad.

En el ojo, la inyección subretiniana es la ruta más minuciosamente estudiado para la terapia génica y la re-administración de AAV de esta manera se ha demostrado que son eficaces en perros afectados y seguro en perros y primates  ( 19 , 72 ), así como para tres pacientes con 1  año de seguimiento después de la re-administración ( 13 ). Una estrategia clínica alternativa para evitar la adaptación por el sistema inmune sería para inyectar ambos ojos simultáneamente. Cirugía bilateral, sin embargo, incurre en un aumento del riesgo para la visión residual del paciente en el caso de una complicación quirúrgica. Como solución de compromiso, estudios bilaterales actuales en los seres humanos tienen por objeto operar en cada ojo 7-14  días de diferencia, que es un tiempo lo suficientemente corto como para ser considerado un "evento" por el sistema inmune.

 

Conclusión

El ojo ha jugado un papel de liderazgo en la traducción clínica de las terapias de transferencia de genes. Dado que la gama de dianas terapéuticas aumenta en el ojo, la respuesta inmune a estos vectores y transgenes continuará para dar forma a la eficacia y la seguridad. La mayor variedad de tejidos diana, así como el gran número de los pacientes tratados es probable que pueda revelar la diversidad de la respuesta inmune sea posible en el ojo que puede informar además la forma en que estudiamos y ejecutar estas terapias.

Mientras que es ciertamente ventajoso que muchos parámetros de estas tecnologías pueden ser de ingeniería - cápsides virales, transgén cassettes, etc - también complica los esfuerzos para agregar los datos de seguridad. Por ejemplo, la terapia optogenético se ha propuesto para la enfermedad de la retina en etapa terminal ( 73 ). En esta técnica, se simplificaron los canales iónicos sensibles a la luz tomados de las plantas Archea podrían ser expresados ​​en tejidos de retina humana. Claramente, la introducción de tales patrones moleculares méritos de estudio a fondo extranjeros, a pesar de que el vector de AAV se ha demostrado que es generalmente seguro.

Prueba de cada modificación técnica en materia de seguridad inmune en modelos animales puede ser exhaustivo y exigente en recursos. Sin embargo, dada la capacidad del sistema inmunológico para la detección de patrones sensible, así como una respuesta inflamatoria potencialmente peligroso, es crítico que los investigadores siguen siendo vigilantes en la comprensión de la biología del sistema inmune y la forma en que las interfaces con estas terapias novedosas.

 

Declaración de conflicto de interés

Keirnan Willett, ninguno

Jean Bennett es un co-autor de una patente "Método de tratamiento o retardar el desarrollo de la ceguera", la patente de EE.UU. 8.147.823 B2, 3 de abril de 2012, pero renunciado a cualquier beneficio económico potencial.

Jean Bennett Es miembro del Consejo Asesor Científico de Avalanche Technologies y es uno de los fundadores de Biológicos GenSight.

 

Agradecimientos

Los autores agradecen el apoyo financiero de: NIH R24EY019861 y DP1EY023177, Howard Hughes Medical Institute Program / Fundación Lucha contra la Ceguera Medical Fellows, TreatRush, Fundación Lucha contra la Ceguera, RPB, Fundación Grousbeck Familia, Mackall Foundation Trust, la Fundación FM Kirby.

 

 

Traducción: Rodrigo Lanzón

Fuente: ncbi.nlm.nih.gov

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Los investigadores podrían reconstruir fotorreceptores

En un estudio pionero en la Universidad de Washington, los investigadores financiados por la FFB descubrieron una forma de células de la retina para regenerar después de la lesión. Si se perfecciona, el enfoque podría utilizarse para restaurar tejido de la retina, y la visión, para las personas con una variedad de enfermedades degenerativas de la retina, incluyendo retinitis pigmentosa y la degeneración macular.

"Esto tiene el potencial de ser un acercamiento para tratar una serie de enfermedades de la retina", dice Stephen Rose, Ph.D., director de investigación de la Fundación Lucha contra la Ceguera. "En lugar de trasplante de células o tejidos extranjeros, está habilitando la retina para sanar y reconstruirse a sí misma. Debido a que es propio tejido de la retina de una persona, que no debería tener que preocuparse de que el tejido sea rechazado ".

"El trasplante consiste en una cirugía complicada, las células no pueden ir exactamente donde queremos que se vayan", dice Thomas Reh, Ph.D., investigador principal del estudio. "Los métodos para estimular la regeneración de desarrollo puede llegar a ser la mejor opción en el largo plazo." Dr. Reh y sus colegas utilizaron un cóctel de proteínas - también conocidos como factores de crecimiento - para estimular el crecimiento de las células de la retina interna dañados en ratones. Los factores de crecimiento engatusan a las células en regresión a un estado inmaduro.Posteriormente, las células inmaduras comenzaron a proliferar en un mayor número de células maduras, sanas de la retina interna. Reh y su equipo creen que un enfoque similar se puede utilizar para regenerar los fotorreceptores, que son células en la retina externa que permiten a la gente ver. 

Dr. Reh señala que la regeneración de la retina se ha demostrado antes en los vertebrados de nivel inferior como el pollo y el pescado, pero nunca antes en los mamíferos. Los resultados de este estudio fueron publicados en la edición de noviembre en línea de Proceedings de la Academia Nacional de Ciencias.

 

Fuente: Fundación Lucha contra la Ceguera Americana (FFB)

 

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Ojo biónico que restaura visión perdida por retinosis pigmentaria.

 

Ojo biónico que restaura visión perdida por retinosis pigmentaria.

Por Roger Dobson, Daily Mail

Por primera vez en casi 20 años, Delvin Kehoe puede verse a sí mismo en el espejo.

Dos décadas después de que perdió la vista como consecuencia de la enfermedad, su visión ha sido restaurada gracias a un dispositivo implantado en el ojo derecho.

Su hermano gemelo, Melvin, que fue cegado por la misma enfermedad degenerativa, también ha tenido visión restaurada por la misma operación.

Delvin, de 59 años, ahora se puede ver las luces, formas, pájaros, e incluso su propia cara. "Me miré en el espejo y ahí estaba yo, y esa fue la primera vez que yo me había visto por más de 18 años", dice.

Él y su hermano son dos de las seis personas en el mundo que tienen un nuevo dispositivo de alta tecnología, la retina de silicio artificial, implantado en sus ojos.

No sólo los dispositivos que ayudan a proporcionar una visión, ha alentado a las células inactivas para empezar a trabajar de nuevo, también. En un caso, un paciente que no podía leer nada en una gráfica optométrica puede ahora identificar 24 letras.

"Lo que es realmente interesante es que el implante también parece ser estimula la retina a su alrededor. Así que hay mejoría funcional allí también.

Las personas no sólo están viendo la luz y la oscuridad, algunos ven las caras, las hojas de hierba, hojas de los árboles ", dice el Dr. Alan Chow, co-inventor de la tecnología, cuyo trabajo está siendo reportado en el Congreso Internacional de Investigación del Ojo en Suiza a finales de este año.

Las ofertas de tecnología esperan millones de personas que han perdido la vista a causa de dos de las causas más comunes de ceguera: la retinosis pigmentaria (RP), de la que Delvin Kehoe sufre, y la degeneración macular relacionadas con la edad (AMD).

En ambas enfermedades, los bastones y conos, que son los sensores de luz en la retina humana en la parte posterior del ojo están dañadas, lo que resulta en una incapacidad para percibir la luz. Por lo tanto, las imágenes visuales que entren a través de la lente que todavía funciona nunca llegan al cerebro debido a las células dañadas, aunque el cerebro es capaz de recibir las imágenes.

Científicos en Estados Unidos, Australia y Alemania han estado trabajando en chips, computadoras micro, cámaras de vídeo pequeñas, rayos láser, y transmisores de radio para superar este obstáculo.

Casi todos estos proyectos se encuentran todavía en las primeras etapas de planificación. Dr. Chow ha diseñado un sistema mucho más simple que utiliza la luz natural que entra a través del ojo para activar la retina artificial.

Su empresa ya ha implantado la retina artificial en seis pacientes - de edades comprendidas entre 45 y 75 - y otros cuatro están siendo reclutados. Si todo sigue así, el dispositivo podría estar listo para su uso más general - y estar disponible para los pacientes británicos - un plazo de cinco años a partir de los ensayos y la aprobación de mayor escala.

La retina artificial es un chip de aproximadamente 2 mm de ancho, con 3.500 a 5.000 sensores de luz que convierten la energía de la luz en señales eléctricas. Estas señales están diseñados para estimular directamente las células restantes de la retina.

Cuando el chip se implanta detrás de la retina, estimula las partes dañadas, pero aún viable de que reaccione a la luz de nuevo. "Está diseñado para funcionar con la energía proporcionada por la luz que entra en el ojo," dice el Dr. Chow. "No requiere cables de conexión, baterías y otros dispositivos auxiliares.

Una vez que el pequeño chip se ha implantado quirúrgicamente, se mantiene en su lugar por la presión natural dentro del ojo. Un hallazgo inesperado es que las mejoras en cuatro de los pacientes no se limitan a la zona cubierta por el implante, sino que implican una mayor parte del campo visual.

Se cree que este renacimiento de las células circundantes puede ser causada por la estimulación eléctrica proporcionada por el dispositivo.. "Parece ser la causa de otras células que despiertan de un estado latente," dice el Dr. Chow.

'Si esto es realmente la forma en que funciona, estos dispositivos podrían prevenir o retrasar la progresión de estas enfermedades. Las implicaciones son enormes.

"No sólo estamos confiando en los pacientes, en sus impresiones. Ahora tenemos datos que indican que se han producido mejoras en la función visual. Las cosas que no se ven desde hace años son ahora visibles a los pacientes '.

Para Delvin Kehoe, que vive en Wisconsin en los Estados Unidos, los resultados del implante son "absolutamente espectaculares". "A causa de la cirugía y la curación los efectos continuaron unas seis semanas,

"Yo estaba tomando los perros a pasear por el parque y oí gansos volando sobre mí. Miré hacia arriba y pude verlos. Fue una experiencia extraordinaria.

"Ahora puedo ver todo tipo de formas y luces. No te puedes imaginar lo que es como si de repente al ver estas cosas después de 18 años ". Otro de los seis pacientes, Ted Ekstrom, que perdió la vista hace 30 años, ahora puede ver las luces y formas.

"Puedo ver las llamas en la chimenea, y poco después de la cirugía, estaba fuera de la casa cuando miré hacia arriba y vi algo - creo que fue la luz del sol en los canalones de la casa de al lado.

-Grité: '¡Oh Dios mío, puedo ver ". Realmente no lo podía creer. De vuelta a casa pude ver todas las luces de la calle que pasaban, así como los faros de los coches que vienen hacia nosotros.

Si los resultados demuestran científicamente que es tan bueno como su sonido, a continuación, señalan una nueva esperanza para miles de británicos ciegos esperando tecnología que podría renovar su visión de forma permanente.

Sobre la Retina Artificial silicio Optobionics '™ microchip (ASR ™) fue inventado por el Dr. Alan Chow y su hermano Vincent Chow. Dr. Chow es un cirujano oftalmólogo y profesor asistente y su hermano Vincent es un ingeniero eléctrico. La ASR fue diseñado para estimular las células retinianas dañadas desde dentro de la retina para permitir a las células para recrear señales visuales que son procesados ​​y enviados al cerebro. El ASR microchip es un chip de silicio de 2 mm de diámetro, 25 micras de espesor y es menor que el espesor de un cabello humano. Se fabrica utilizando tecnología similar a la utilizada en la fabricación de chips de ordenador y contiene aproximadamente 5.000 células solares microscópicas llamadas "micro-fotodiodos", cada uno con su propio electrodo de estimulación.     En retinas con degeneración de la retina, estas microfotodiodos convierten la energía contenida en la luz imágenes en impulsos electroquímicos que estimulan las células de la retina restantes. El ASRmicrochip es autónomo, impulsado únicamente por la luz incidente y no requiere el uso de cables externos, baterías, auriculares o equipos auxiliares.

     Cuando se implanta quirúrgicamente debajo de la retina en una ubicación conocida como "espacio subretiniano"-el chip ASR está diseñado para producir señales visuales similares a los producidos por la capa de fotorreceptores. Desde su ubicación subretiniano, estas señales artificiales "fotoeléctricas" de la ASR microchip puede inducir visual
señales en las células de la retina funcionales restantes que pueden luego se procesan y se envían a través del nervio óptico al cerebro.


     En las pruebas iniciales de laboratorio, los modelos animales implantados con dispositivos ASR respondieron a la luz estímulos con señales eléctricas retina (ERG) y las señales de veces de las ondas cerebrales (PEV). La inducción de estas señales biológicas por el chip ASR indicó que se había producido la estimulación visual.


     En base a estos estudios, la FDA aprobó la realización de ensayos clínicos en colaboración con varios centros médicos de VA universidad y que se inició en junio de 2000. Estos centros incluyen el Hines, Cleveland y los Centros de Atlanta Veterans Administration Medical, Rush University Medical Center, Johns Hopkins Wilmer Eye Institute y el Centro Médico de la Universidad de Emory.

Traducción: Rodrigo Lanzón

 

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